各位小伙伴们，大家好~欢迎大家又来到了一周一次的火火数据库专栏。本周我们继续发扬不把circ搞废不罢休的刻苦钻研打工人精神，深挖这个新兴热点分子背后的故事。然而，说到今天的主角，circPrimer 1.2软件，我不得不说，我大意了啊，居然现在才掏出来跟大家唠唠。眼尖的小伙伴们想必已经发现了事情并不简单，对的，今天说的不是数据库，而是一个免安装的小软件，经过本火长达一个月的考评研究，不得不感叹一句，“真香啊！”。其实用性，便捷性，功能的强大性值得我在这里再吹一波300字彩虹屁了，简直谁用谁知道，丁真用了都不想去拉萨（狗头.jpg）。好了，接下来我们进入正题，展开说说这个被我夸的天花乱坠的小软件到底是何方神圣。
一、软件安装与基本介绍
下载好软件压缩包后，右键解压缩，大家重点关注“circPrimer”应用程序以及“help”说明书。后者提供了详细的中文版解说教程，如果火火哪里介绍的给大家带来了困扰，大家可以再仔细翻翻说明书喔~
双击“circPrimer”应用程序运行，进入软件主页面，可以看到整个页面非常简洁，大致分为四个展示区域。
左上角的编辑框中可以输入circbase ID (如hsa_circ_0000007)、circRNA的基因坐标(如chr1:1735857-1737977)、宿主基因的gene symbol、或者事先已经整理好的txt文本文件的路径来进行检索
左侧可以更改hg19/hg38版本信息，或点击下方UCSC按钮获取circRNA剪切序列和基因组序列；
中间位置的几个按钮用于设计circRNA的引物；
右侧展示框用于展示使用者各项操作后的结果。
circPrimer软件的功能非常丰富，接下来将针对circRNA研究过程中最常用的几个功能进行相应的介绍。
二、图形化注释circRNA
以hsa_circ_0046598为例，在“1”处编辑框中输入hsa_circ_0046598（此处可以输入的数据类型有：circbase ID、circRNA基因坐标和宿主基因的gene symbol），点击“circbase”按钮。页面刷新后可以看到屏幕中间显示框中显示了该circRNA的序列信息，右侧显示框展示了其染色体上的位置。如编辑框中输入的是某宿主基因，则该处展示的是该宿主基因所能编码的所有circRNA。
点击“circRNA”下的circbase ID或“chr”下的这段染色体序列，页面中央出现了该circRNA的图形化注释信息。如果该circRNA存在于circbase数据库中，图片左上角会以蓝色文本显示circbase数据库中该circRNA的相关信息，第一行是circbase ID和宿主基因的gene symbol，第二行是circRNA的基因坐标，第三行是宿主基因的编号，第四行是circRNA的序列长度。图片同时提供了circRNA的外显子和内含子构成等信息，如hsa_circ_0046598由宿主基因7-11号外显子组成，第7号和第11号外显子封闭成环，形成反向剪切位点。顶部数据分别是环状RNA结束和起始碱基的序号。
点击“Annotate”按钮，主屏幕会显示更加详细的信息，如下图所示。
CDS：编码区；
UTR：非编码区；
start_codon：起始密码子；
stop_codon：终止密码子。
返回软件安装位置，可以发现图形化注释的circRNA图片已经自动保存到了文件夹里。
如果将上周分享的富贵论坛数据库与circPrimer软件进行比对，可以发现部分circRNA两处标注的外显子组成结构并不一致，个人在使用过程中更倾向于相信circPrimer的结果，其外显子组成结构更为连续，可以与NCBI的数据相互佐证。
三、circRNA引物设计
circRNA之难，难于上青天。打败科研新手第一步的就是引物设计了。不同于线性RNA的对向引物，circRNA要求使用背靠背引物，且扩增出来的片段包含反向剪切位点。由于circRNA的表达丰度也很低，所以从设计引物到引物验证到sanger测序，步步都是坑。好在circPrimer软件提供了足够强大和靠谱的引物设计功能，可以供用户直接使用。在这里小小声说一句，尽管circInteractome数据库也可以设计引物，但是个人感觉circPrimer更靠谱~
我们继续以hsa_circ_0046598为例进行说明。点选“Divergent primer”引物，然后点击“Template”按钮，软件会自动将环状RNA序列从中间分开并将两段序列位置互换，通过符号“【”和“】”框定接头处碱基来告知Primer3产物要包括该接头（circPrimer软件通过将转换后的序列链接至Primer3来设计引物）。如图中所示，【GG】即为hsa_circ_0046598反向剪切位点处的碱基。
此时模板序列已经自动拷贝到电脑粘贴板中，点击软件“Primer3 (V4.1)”链接，粘贴模板序列，并将Product Size Ranges改为50-100（荧光定量PCR扩增片段最大不可超过250），然后点击“Pick Primers”按钮。
页面刷新后即可看到设计的引物序列。
如果上一步无法得到引物，可对参数设置进行适当修改：
四、检测引物特异性
接下来这个功能就是我最爱的环节了。线性mRNA的引物尚有NCBI可以进行Blast，circRNA引物的blast仅此一家。点击Check Primer，右侧刷新后即出现了可供引物Blast的编辑框。
将上一步操作中获得的引物序列输入到编辑框中（F: GAATCCCCATCCTGCACTTC，R：GGGGCCATTTGAGGTGAAAA），点击“check”。
页面刷新后可以看到该引物仅Blast出了一条circRNA，即我们想要的目的circRNA。点击“hsa_circ_0046598”，同样可以出现图形化注释信息，但是与上文不同的是，此处同时提供了引物在circRNA上结合的位置。上方的“F”和“R”即两条引物结合的位置。
如果你的目的circRNA仅有2-3个外显子组成，设计的背靠背引物其实很有可能会blast出其宿主基因所能转录出的其他circRNA，此时引物的特异性就会很低。为了解决这个问题，可以考虑缩短扩增时间或设计跨剪切位点的引物，大家有需求的话可以参考说明书或者在推文下方留言，我们下次再详细说说这个问题哦~
circPrimer的功能除了上述之外还有许多可供挖掘，火火只是列举了个人认为帮助最大，使用最广泛的几个用途。别看看上去很简单，没有它的话平白要耗费很多功夫。以外显子构成举例，我当时亲眼看着某公司销售操作了一番：先去circbase数据库下载circRNA的fasta格式文件，然后去NCBI查宿主基因的信息，查看各个外显子的起始和终止碱基位置，再把circRNA的序列去跟它匹配，计算circRNA到底是第几到第几个外显子组成。。。是不是听着就很窒息，circPrimer点一点就能解决，我就问你香不香！
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